https://www.mdpi.com/1999-4915/13/10/2056/htm
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3. Ergebnisse
3.1. Wirkung von nuklear-lokalisierten SARS-CoV-2 viralen Proteinen auf die Reparatur von DNA-Schäden
Die Reparatur von DNA-Schäden erfolgt hauptsächlich im Zellkern, um die Genomstabilität zu gewährleisten. Obwohl SARS-CoV-2 Proteine im Zytosol synthetisiert werden [ 1 ], sind einige virale Proteine auch im Zellkern nachweisbar, darunter Nsp1, Nsp5, Nsp9, Nsp13, Nsp14 und Nsp16 [ 19 ]. Wir untersuchten, ob diese im Kern lokalisierten SARS-CoV-2-Proteine das DNA-Schadensreparatursystem der Wirtszelle beeinflussen. Dazu konstruierten wir diese viralen Proteinexpressionsplasmide zusammen mit Spike- und Nukleoprotein-Expressionsplasmiden, die allgemein als zytosollokalisierte Proteine gelten. Wir bestätigten ihre Expression und Lokalisation durch Immunblotting und Immunfluoreszenz ( Abbildung 1 A und Abbildung S1A). Unsere Ergebnisse stimmten mit denen aus früheren Studien überein [ 19 ]; Nsp1-, Nsp5-, Nsp9-, Nsp13-, Nsp14- und Nsp16-Proteine sind tatsächlich im Zellkern lokalisiert, und Nukleoproteine sind hauptsächlich im Zytosol lokalisiert. Überraschenderweise fanden wir die Häufigkeit des Spike-Proteins im Zellkern ( Abbildung 1 A). NHEJ-Reparatur und homologe Rekombination (HR) sind zwei wichtige DNA-Reparaturwege, die nicht nur die Genomintegrität kontinuierlich überwachen und sicherstellen, sondern auch für die adaptiven Immunzellfunktionen von entscheidender Bedeutung sind [ 9]. Um zu beurteilen, ob diese viralen Proteine den DSB-Reparaturweg behindern, untersuchten wir die Reparatur eines ortsspezifischen DSB, der durch die I-SceI-Endonuklease induziert wurde, unter Verwendung des Direct-Repeat-Green-Fluoreszenz-Proteins (DR-GFP) und des Gesamt-NHEJ-GFP ( EJ5-GFP)-Reportersysteme für HR bzw. NHEJ [ 15 , 16 ]. Die Überexpression von Nsp1-, Nsp5-, Nsp13-, Nsp14- und Spike-Proteinen verringerte die Effizienz der HR- und NHEJ-Reparatur ( Abbildung 1 BE und Abbildung S2A,B ). Darüber hinaus fanden wir auch, dass die Überexpression von Nsp1, Nsp5, Nsp13 und Nsp14 die Proliferation im Vergleich zu anderen untersuchten Proteinen dramatisch unterdrückt ( Abbildung S3A,B). Daher kann die hemmende Wirkung von Nsp1, Nsp5, Nsp13 und Nsp14 auf die Reparatur von DNA-Schäden auf sekundäre Wirkungen, wie Wachstumsarrest und Zelltod, zurückzuführen sein. Interessanterweise beeinflusste überexprimiertes Spike-Protein weder die Zellmorphologie noch die Zellproliferation, unterdrückte jedoch signifikant sowohl die HR- als auch die NHEJ-Reparatur ( Abbildung 1 BE, Abbildungen S2A,B und S3A,B ).
3.2. SARSCoV2 Spike Protein hemmt die Reparatur von DNA-Schäden
Da Spike-Proteine für die Vermittlung des viralen Eintritts in Wirtszellen von entscheidender Bedeutung sind und im Mittelpunkt der meisten Impfstoffstrategien stehen [ 20 , 21 ], haben wir die Rolle von Spike-Proteinen bei der Reparatur von DNA-Schäden und der damit verbundenen V(D)J-Rekombination weiter untersucht. Spike-Proteine werden normalerweise auf dem rauen endoplasmatischen Retikulum (ER) synthetisiert [ 1 ]. Nach posttranslationalen Modifikationen wie der Glykosylierung wandern Spike-Proteine über den zellulären Membranapparat zusammen mit anderen viralen Proteinen zum reifen Virion [ 1 ]. Das Spike-Protein enthält zwei Hauptuntereinheiten, S1 und S2, sowie mehrere funktionelle Domänen oder Wiederholungen [ 22] ( Abbildung 2 A). Im nativen Zustand existieren Spike-Proteine als inaktive Proteine voller Länge. Während einer Virusinfektion aktivieren Wirtszellproteasen wie die Furinprotease das S-Protein, indem sie es in S1- und S2-Untereinheiten spalten, was für den viralen Eintritt in die Zielzelle notwendig ist [ 23 ]. Wir untersuchten weiterhin verschiedene Untereinheiten des Spike-Proteins, um die funktionellen Merkmale aufzuklären, die für die Hemmung der DNA-Reparatur erforderlich sind. Nur das Spike-Protein voller Länge hemmte sowohl die NHEJ- als auch die HR-Reparatur stark ( Abbildung 2 BE und Abbildung S4A,B). Als nächstes versuchten wir zu bestimmen, ob das Spike-Protein direkt zur genomischen Instabilität beiträgt, indem es die DSB-Reparatur hemmt. Wir überwachten die Spiegel von DSBs mit Comet-Assays. Nach verschiedenen Behandlungen von DNA-Schäden, wie -Bestrahlung, Doxorubicin-Behandlung und H 2 O 2 -Behandlung, findet in Gegenwart des Spike-Proteins weniger Reparatur statt ( Abbildung 2 F,G). Zusammen zeigen diese Daten, dass das Spike-Protein die DNA-Reparatur im Zellkern direkt beeinflusst.
3.3. Spike-Proteine behindern die Rekrutierung von Checkpoint-Proteinen zur Reparatur von DNA-Schäden
Um die Existenz von Spike-Protein im Zellkern zu bestätigen, führten wir eine subzelluläre Fraktionsanalyse durch und fanden heraus, dass Spike-Proteine nicht nur in der Zellmembranfraktion angereichert sind, sondern auch in der Kernfraktion reichlich vorhanden sind, mit nachweisbarer Expression sogar in der chromatingebundenen Fraktion ( Abbildung 3A ). Wir beobachteten auch, dass der Spike drei verschiedene Formen hat, die obere Bande ist eine hochglykosylierte Spike, die mittlere ist eine Spike voller Länge und die untere ist eine gespaltene Spike-Untereinheit. In Übereinstimmung mit dem Comet-Assay fanden wir auch die Hochregulierung des DNA-Schadensmarkers γ-H2A.X in Spike-Protein-überexprimierten Zellen unter DNA-Schädigungsbedingungen ( Abbildung 3B). Eine aktuelle Studie legte nahe, dass Spike-Proteine ER-Stress und ER-assoziierten Proteinabbau induzieren [ 24 ]. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass das Spike-Protein die DNA-Reparatur hemmt, indem es den Abbau des DNA-Reparaturproteins fördert, haben wir die Expression einiger essentieller DNA-Reparaturproteine in den NHEJ- und HR-Reparaturwegen überprüft und festgestellt, dass diese DNA-Reparaturproteine nach der Überexpression des Spike-Proteins stabil waren ( Abbildung 3 C). Um zu bestimmen, wie das Spike-Protein sowohl die NHEJ- als auch die HR-Reparaturwege hemmt, analysierten wir die Rekrutierung von BRCA1 und 53BP1, die die wichtigsten Checkpoint-Proteine für die HR- bzw. NHEJ-Reparatur sind. Wir fanden heraus, dass das Spike-Protein die Bildung von BRCA1- und 53BP1-Foci deutlich hemmte ( Abbildung 3DG). Zusammen zeigen diese Daten, dass das SARS-CoV-2 Spike-Protein in voller Länge die Reparatur von DNA-Schäden hemmt, indem es die Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen behindert.
3.4. Spike-Protein beeinträchtigt die V(D)J-Rekombination in vitro
Die Reparatur von DNA-Schäden, insbesondere der NHEJ-Reparatur, ist für die V(D)J-Rekombination essentiell, die den Kern der B- und T-Zell-Immunität bildet [ 9 ]. Bis heute wurden viele zugelassene SARS-CoV-2-Impfstoffe, wie mRNA-Impfstoffe und Adenovirus-COVID-19-Impfstoffe, basierend auf dem Spike-Protein in voller Länge entwickelt [ 25 ]. Obwohl fraglich ist, ob SARS-CoV-2 direkt Lymphozyten-Vorläufer infiziert [ 26 , 27 ], haben einige Berichte gezeigt, dass infizierte Zellen Exosomen sezernieren, die SARS-CoV-2 RNA oder Protein an Zielzellen abgeben können [ 28 , 29]. Wir testeten weiter, ob das Spike-Protein die NHEJ-vermittelte V(D)J-Rekombination reduzierte. Dazu haben wir gemäß einer früheren Studie [ 18 ] ein in vitro V(D)J-Rekombinations-Reportersystem entworfen ( Abbildung S5 ). Im Vergleich zum leeren Vektor hemmte die Überexpression des Spike-Proteins die RAG-vermittelte V(D)J-Rekombination in diesem in vitro-Reportersystem ( Abbildung 4 ).
Zusammengefasst:
nsere Ergebnisse liefern Beweise dafür, dass das Spike-Protein die DNA-Schadensreparaturmaschinerie und die adaptive Immunmaschinerie in vitro entführt. Wir schlagen einen möglichen Mechanismus vor, durch den Spike-Proteine die adaptive Immunität beeinträchtigen können, indem sie die Reparatur von DNA-Schäden hemmen. Obwohl keine Beweise veröffentlicht wurden, dass SARS-CoV-2 Thymozyten oder lymphoide Knochenmarkszellen infizieren kann, zeigt unser in vitro V(D)J-Reporter-Assay, dass das Spike-Protein die V(D)J-Rekombination stark behindert. In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen zeigen klinische Beobachtungen auch, dass das Risiko einer schweren Erkrankung oder eines Todes bei COVID-19 mit dem Alter zunimmt, insbesondere bei älteren Erwachsenen mit dem höchsten Risiko [ 22]. Dies könnte daran liegen, dass SARS-CoV-2 Spike-Proteine das DNA-Reparatursystem älterer Menschen schwächen und folglich die V(D)J-Rekombination und die adaptive Immunität behindern können. Im Gegensatz dazu liefern unsere Daten wertvolle Details über die Beteiligung von Spike-Protein-Untereinheiten an der Reparatur von DNA-Schäden, was darauf hindeutet, dass Spike-basierte Impfstoffe voller Länge die Rekombination von V(D)J in B-Zellen hemmen können, was auch mit einer neueren Studie, dass ein Spike-basierter Impfstoff voller Länge niedrigere Antikörpertiter induzierte als der RBD-basierte Impfstoff [ 28]. Dies deutet darauf hin, dass die Verwendung von antigenen Epitopen des Spikes als SARS-CoV-2-Impfstoff sicherer und wirksamer sein könnte als der Spike in voller Länge. Zusammenfassend haben wir einen der potenziell wichtigen Mechanismen der SARS-CoV-2 Suppression der adaptiven Immunmaschinerie des Wirts identifiziert. Darüber hinaus implizieren unsere Ergebnisse auch eine mögliche Nebenwirkung des Impfstoffs auf Spike-Basis in voller Länge. Diese Arbeit wird das Verständnis der COVID-19-Pathogenese verbessern und neue Strategien für die Entwicklung effizienterer und sichererer Impfstoffe liefern. |
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